共聚焦显微镜在亚细胞荧光染色实验中应用

共聚焦显微镜在亚细胞荧光染色实验中应用
链霉抗生物素蛋白一生物素一过氧化物酶法免疫染色    为了防止切片干燥，整个染色过程应在湿盒中进行。这里描述的方案目的在于高灵敏度和省略复染，这样可以检测甚至微弱的阳性反应，并能提供足资保存的黑白照片，并可避免通常用苏木精核复染造成的干扰。    ①复水后的冰冻切片或石蜡切片(后者需进行暴露抗原步骤以应必须)已可进行染色。为了阻断一抗的非特异性结合，用含有5％～20％正常血清(和二抗中所用同种动物的血清)的溶液预处理切片(如在本例中用生物素化的抗体)室温孵育20分钟。    ②吸干切片上多余的封闭液。    ③用对所研究周期蛋白质特异的第一抗体孵育切片。一抗可以是一种杂交瘤组织培养上清液，或多克隆或单克隆抗体(纯化的或腹水)。用加有载体蛋白(3％BSA或10％血清，最好用与第一步中用于阻断非特异结合的同种属的血清)的PBS适当地稀释一抗。抗体合适的稀释度与最适的孵育时间必须根据预染色实验确定，但一般对多克隆抗血清和腹水稀释度在基菲吮，碘化丙锭〕。可透过多种荧光的滤光装置(用于观测多种荧光染料在进行基Vi定位时非常有用，因为用不161的滤光器观测标记荧光和逆染色可能产生记录误差，以及很难在染色体的正确位置上标绘出荧光信号)。例如染色体以DA PI染色时，一个可透过三种荧光的滤光器允许同时观测德州红和FITC信号。虽然共聚焦显微镜在亚细胞荧光抗体染色实验中有用，但在FISH中并不适用，因为它的影像分辨率一般不如标准的荧光，而且激光照明光源的强度足以迅速淬灭样品。但是在用FISH研究厚组织切片时可以充分利用共聚焦显微镜