DNA探针非同位素标记,一般荧光素或酶等作标记

DNA探针非同位素标记,一般荧光素或酶等作标记
 DNA探针的非同位素标记法，一般以荧光素、生物素或酶等作标记物。如以生物素直接标记，以酶、亲和素或荧光作检测系统。近来合成的光生物素可直接标记，操作比较简便，价廉安全，5微米的DNA即可检出160pg的大肠杆菌DNA，全过程仅需2—3h。也有用数种物质(如同位素、生物素)同时标记在同一个探针上．按不同信号(显色、发光)于同一标本中可检出数个DNA序列，即应用两枚探针，其一端标以催化剂，另一端为化学发光复合物，以反方向与待测DNA两端同时杂交，待二探针逐渐靠拢时，其中催化剂端激发另一端的光复合物而发出光信号，特异性强，不需固定DNA，也不必清洗未结合的标记物。除了同位素标记、荧光素、生物素标记或酶标记外，也有用无标记的DNA探针，即以抗原抗体反应及酶显色法为基础，先将未标记的探针与待检单链DNA片段杂交，再加入非特异抗双链DNA单克隆抗体(酶标抗体)，如二者为互补．即可结合而显色
    原位杂交条件的控制    普遍认为，组织切片厚度并不影响杂交结果，增加切片厚度并不能相应增加杂交信号，这可能与探针的渗透能力有关，不论使用何种探针，杂交前必须对组织进行预处理，以增强探针对组织的渗透能力和杂交特异性。预处理因素中至关重要的是蛋白酶E或K和胰蛋白酶对组织的消化。石蜡切片不用蛋白酶消化或消化不充分，常不能检出靶DNA，消化过度可导致组织的脱落，因此，酶消化程度以既能充分打开蛋白质外膜，又能保存组织良好形态，不使DNA因细胞结构破坏而丢失。