PcR法以其快速、灵敏特点而广泛应用在转化子的筛选

PcR法以其快速、灵敏特点而广泛应用在转化子的筛选
   PCR扩增的优化  特异性、忠实性和有效性是检测PCR扩增的三个标准。三者有时不可兼得，高特异性的反应条件与高产量的反应条件并不一致，高保真的扩增会导致低产率。因此应该    根据实验目的优化反应条件。    PCR扩增的特异性主要是由引物的特异性和循环参数来决定的。循环参数中最主要的是退火温度和退火时间。提高退火温度和降低退火时间能有效地提高反应的特异性。减少延伸时间、减少ngE酶量、减少循环次数能提高特异性。    采用高保真的了kgE可以降低反应产物的变异，但其扩增效率有可能降低。    由于制备模板DNA分子时，会产生一定量的单链DNA分子，这些单链非靶DNA分子在低温下能与引物退火，随后的扩增反应能产生非特异性扩增。   PcR法以其快速、灵敏的特点而广泛应用在转化子的筛选上。传统的筛选转化菌落需要提取质粒后进行PCR检测，考虑到PCR扩增对模板的纯度要求不高，因此可以直接用菌落扩增，而不用先提取质粒后再扩增筛选。PCR引物既可以是插入基因的特异引物，也可以是载体多克隆位点两端的引物(如T7、T3、SP6、M13等)。采用基因特异引物可直接筛选出目的克隆，而用多克隆位点两端的引物可以得到插入片段长度的信息。