不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定技术

不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定技术
从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。目前发展起来的成熟筛选方法如下。    (1)插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因(Yc生素基因或卢—半乳糖苷酶基因)的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出与转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。目前常用的是口一半乳糖苷酶显色法，即蓝白筛选法。    (2)PCR筛选和限制性内切核酸酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切核酸酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。    (3)核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段或是以目的基因表达蛋白质的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸或其他物种的同源基因。    (4)免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白质抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可以是从生物本身纯化出的目的基因表达蛋白质抗体，也可以是从目的基因部分可读框(open reading fμme，ORF)片段克隆在表达载体中获得表达蛋白质的抗体。    上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。