蔗糖密度梯度区带沉淀法测定分子质量分析显微镜

蔗糖密度梯度区带沉淀法测定分子质量分析显微镜
蔗糖密度梯度区带沉淀法测定分子质量
    蔗糖密度梯度区带离心法分离大分子物质，是根据待分离的物质在离心场中的沉降速度不同而设计的。由于大分子物质在离心场中迁移速度的差异而有各自的沉降系数，反映出它的质量、形状、密度和水合状态。因而，进行适当控制和测定其特有体积(大分子物质密度的一个测量指标)，即可估计出相对分子质量，也可根据得出的Stokes半径(Rs)计算出分子质量。    不变性条件下分离得到多蛋白复合体或同聚体蛋白的寡聚体，沉淀分析可测定它们的分子质量。沉降法尤其适用于测定球状水溶性蛋白质的分子质量，有去污剂存在时整合膜蛋白分子质量的测定也可用该方法，此时由于受到一定限制仅可测出分子质量的近似值。重要的是，如果测定出不同种蛋白质或蛋白复合体(如细胞裂解液、组织匀浆液、细胞上清液、血清)的特有性质(如酶活性、抗体结合能力或吸光度)，那么也可用这种方法分析。沉降以匀速进行时，蔗糖梯度可以抵抗分子散射和机械干扰，使大分子物质稳定沉淀。    传统的沉降实验对蛋白复合体(尤其是有去污剂存在时的整合膜蛋白)进行大致分离，仅能粗略估计分子质量，但对于球状水溶性蛋白质，用这种方法得出的分子质量与实际分子质量接近。区带沉淀主要用于蛋白质的分析，该种方法也适用于包括病毒和小分子核酸等核蛋白复合体相对分子质量的测定。    利用区带离心对样品(如细胞裂解液)进行初步分离，首先将样品通过蔗糖梯度超速离心，再对梯度液洗脱分为若干部分。因而区带离心受到不同区带内的蛋白质测定方法和蛋白质自身的沉降系数以及相对分子量计算方法的限制。要得到有意义的结果，必须设计和制定出相应的方法。此外，还要考虑分离范围和分辨率，以便测定梯度的斜率、超速离心用的试管的大小和超速离心的长短。最后，必须考虑梯度形成和分离方法的多样性，选择达到目的的最佳方法和(或)现有设备。